Плазмиды. Роль плазмид в генной инженерии

Страница 1

Было обнаружено, что у многих видов бактерий помимо основной массы ДНК, находящейся в «бактериальной хромосоме» (несколько миллионов пар оснований) имеются еще «крошечные» кольцевые, двунитевые и суперскрученные молекулы ДНК. Они были названы плазмидами - по месту расположения их в протоплазме клетки. Количество пар оснований в плазмидах ограничено диапазоном от 2-х до 20-ти тысяч. Некоторые бактерии имеют только по одной плазмиде. В других - их обнаруживается несколько сотен.

В норме плазмиды редуплицируются при делении бактериальной клетки одновременно с основной ДНК хромосомы. Для своего размножения они используют «хозяйские» ДНК-полимеразы I, III и другие ферменты. Плазмиды синтезируют свои специфические белки, для чего используется РНК-полимераза и рибосомы, также принадлежащие бактерии-хозяину. В числе этих «продуктов деятельности» плазмид иногда оказываются вещества, разрушающие антибиотики (ампимицин, тетрациклин, неомицин и другие). Что придает самой бактерии-хозяину устойчивость против воздействия этих антибиотиков, если она сама по себе таковой устойчивостью не обладает. Мало того. «Самостоятельность» некоторых плазмид простирается до того, что они оказываются способными размножаться в клетке бактерии даже тогда, когда синтез белка в ней (а следовательно, и ее деление) блокированы действием специфических ингибиторов. В этом случае в бактерии может накопиться до 2-3 тысяч плазмид.

Очищенные плазмиды способны проникать из питательной среды внутрь клеток чужеродных бактерий, там обосновываться и нормально размножаться. Правда, для этого приходится предварительно увеличивать проницаемость оболочек этих бактерий, обрабатывая их раствором хлористого кальция.

Успешное встраивание чужой плазмиды удается лишь для ничтожного меньшинства клеток обрабатываемой популяции. Однако если бактерия-реципиент не обладала устойчивостью к определенному антибиотику, а «прижившаяся» плазмида эту устойчивость ей сообщает, то даже из единичных успешно «трансформированных» бактерий на питательной среде с добавкой антибиотика можно вырастить вполне полноценные колонии, наследственно обладающие встроенной плазмидой.

Наконец, самое важное. Если в ДНК плазмиды (до начала трансформации) удастся «встроить» фрагмент вовсе чуждой для нее ДНК (например ген животного происхождения), то этот фрагмент вместе с плазмидой войдет внутрь клетки реципиента, вместе с ней будет размножаться и направлять внутри бактерии синтез «псевдоплазмидных» белков, закодированных в этом гене!

Вспомним теперь с какой скоростью размножаются бактерии в жидкой питательной среде, поддерживая и приумножая при этом синтез плазмидных (а также «псевдоплазмидных»!) белков. Очевидно, что здесь просматривается перспектива наработки большого количества индивидуального белка - продукта деятельности вторгнувшегося («тайком») в бактерию гена. Остается решить проблему встраивания именно избранного гена в плазми-ду. А также и получения первоначально необходимого количества этого самого гена, если отправным пунктом является известная (хотя бы частично) структура интересующего нас белка. Вот тут-то и раскроются уникальные возможности использования рестриктаз.

Но сначала несколько слов о выделении самих плазмид из клеток их нормальных бактерий-хозяев. Это - дело не сложное. Из бактерии можно очистить суммарную ДНК, как это было описано раньше. Потом одним из физических методов отделить низкомолекулярную ДНК плазмид от сравнительно высокомолекулярной ДНК бактериальной хромосомы. Надо только позаботиться о том, чтобы при вскрытии клетки не появились малые обломки основной ДНК. В частности, не следует пользоваться для разрушения оболочек бактерий ультразвуком.

Можно поступить проще. Сферопласты бактерий обработать слабой щелочью + DDC-Na или прокипятить в течение 1 минуты. ДНК бактериальной хромосомы, вместе со связанными с ней белками, денатурируется и выпадает хлопьями в осадок. Ее легко удалить центригурированием. ДНК кольцевых плазмид также сначала денатурируется. Но поскольку ее однонитевые кольца топологически связаны, они разойтись не могут. После восстановления нормальных условий среды ренатурируется и нативная структура плазмид. Они остаются в растворе.

За последние годы выделены и очищены сотни плазмид. Их описание, естественно, начинается с представления полной нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Современ-ные автоматические «секвенаторы» позволяют расшифровать последовательность 4-х-5-ти тысяч пар нуклеотидов за неделю. В 80-е годы, когда секвенирование ДНК производили вручную, такая работа занимала несколько месяцев.

Также смотрите:

Синергетика в современной науке
В последние годы наблюдается стремительный и бурный рост интереса к междисциплинарному направлению, получившему название "синергетика". Создателем синергетического направления и изобретателем термина "синергетика" является профессор Штутгартского у...

Кормовая база
Известно, что выдра питается преимущественно рыбой, главным образом, мелкой, не превышающей в длину 20 см. Второй по важности вид корма - лягушки. Выдра поедает их в течение всего года и особенно много в холодное время, находя места их зимовок. Кормом могут служить та...

Химическая природа и свойства витамина В12.
Химическая природа витамина В12 была установлена в 1955 г. Он оказался самым сложным из всех витаминов с молекулярным весом 1356. Витамин В12 растворяется в воде и спирте, нерастворим в эфире. Его кристаллы темно-красного цвета благодаря наличию атома кобальта. Вит...

№ 28 Плазмиды бактерий, их функции и свойства. Использование плазмид в генной инженерии.
Плазмиды - внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1-5 % ДНК хромосомы. Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды . Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.
Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие :
1) устойчивость к антибиотикам;
2) образование колицинов;
3) продукция факторов патогенности;
4) способность к синтезу антибиотических веществ;
5) расщепление сложных органических веществ;
6) образование ферментов рестрикции и модификации.
Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.
Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.
Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.
Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Несовместимость свойственна тем плазмидам, которые обладают высоким сходством репликонов, поддержание которых в клетке регулируется одним и тем же механизмом.
Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами .
У бактерий различных видов обнаружены R -плазмиды , несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам - антибиотикам, сульфаниламидам и др., F -плазмиды , или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent -плазмиды , детерминирующие продукцию энтеротоксина.
Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ - бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных микроорганизмов.
Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов. Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгационной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.

Плазмиды - фрагменты ДНК с молекулярной массой порядка 106~108 D, несущие от 40 до 50 генов. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.

Автономные плазмиды существуют в цитоплазме бактерий и способны самостоятельно репродуцироваться; в клетке может присутствовать несколько их копий.

Интегрированные плазмиды репродуцируются одновременно с бактериальной хромосомой. Интеграция плазмид происходит при наличии гомологичных последовательностей ДНК, при которых возможна рекомбинация хромосомной и плазмидной ДНК (что сближает их с профагами).

Плазмиды также подразделяют на трансмиссивные (например, F- или R-плазмиды), способные передаваться посредством конъюгации, и нетрансмиссивные.

Плазмиды выполняют регуляторные или кодирующие функции. Регуляторные плазмиды участвуют в компенсировании тех или иных дефектов метаболизма бактериальной клетки посредством встраивания в повреждённый геном и восстановления его функций. Кодирующие плазмиды привносят в бактериальную клетку новую генетическую информацию, кодирующую новые, необычные свойства (например, устойчивость к антибиотикам).

В соответствии с определёнными признаками, кодируемыми плазмидными генами, выделяют следующие группы плазмид:

F-плазмиды. При изучении процесса скрещивания бактерий оказалось, что способность клетки быть донором генетического материала связана с присутствием особого F-фактора [от англ. fertility, плодовитость]. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) с бактериями-реципиентами (F»). В связи с этим можно указать, что сам термин «плазмида» был предложен для обозначения «полового» фактора бактерий (Джошуа Лёдерберг, 1952). F-плазмиды могут быть автономными и интегрированными. Встроенная в хромосому F-плазмида обеспечивает высокую частоту рекомбинации бактерий данного типа, поэтому их также обозначают как Hfr-плазмиды от англ. high frequency of recombinations, высокая частота рекомбинаций].

R-плазмиды [от англ. resistance, устойчивость] кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к антибиотикам и сульфаниламидам, хотя некоторые детерминанты устойчивости правильнее рассматривать как связанные с транспозонами [см. ниже]), а также к тяжёлым металлам. R-плазмиды включают все гены, ответственные за перенос факторов устойчивости из клетки в клетку.

Неконъюгативные плазмиды обычно характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae). Они обычно имеют небольшие размеры (молекулярная масса примерно 1 - 10*106 D). Обнаруживают большое количество мелких плазмид (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве при клеточном делении. Неконъюгативные плазмиды могут быть также перенесены из клетки в клетку при наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид. При конъюгации донор может передать и неконъюгативные плазмиды за счёт связывания генетического материала последних с конъюгативной плазмидой.

Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов. Многие плазмиды, кодирующие образование бактериоцинов, также содержат набор генов, ответственных за конъюгацию и перенос плазмид. Подобные плазмиды относительно крупные (молекулярная масса 25-150*106 D), их довольно часто выявляют у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1~2 копий на клетку. Их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства многих видов, особенно энтеробактерий. В частности F-, R-плазмиды и плазмиды бактериоциногении включают tox+-транспозоны (мигрирующий генетический элемент, см. ниже), кодирующие токсинообразова-ние. Нередко tox+-транспозоны кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом.

Скрытые плазмиды. Криптические (скрытые) плазмиды не содержат генов, которые можно было бы обнаружить по их фенотипическому проявлению.

Плазмиды биодеградации. Обнаружен также ряд плазмид, кодирующих ферменты деградации природных (мочевина, углеводы) и неприродных (толуол, камфора, нафталин) соединений, необходимых для использования в качестве источников углерода или энергии, что обеспечивает им селективные преимущества перед другими бактериями данного вида. Патогенным бактериям подобные плазмиды придают преимущества перед представителями аутомикрофлоры.

100 р бонус за первый заказ

Выберите тип работы Дипломная работа Курсовая работа Реферат Магистерская диссертация Отчёт по практике Статья Доклад Рецензия Контрольная работа Монография Решение задач Бизнес-план Ответы на вопросы Творческая работа Эссе Чертёж Сочинения Перевод Презентации Набор текста Другое Повышение уникальности текста Кандидатская диссертация Лабораторная работа Помощь on-line

Узнать цену

Плазмиды - дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

F-плазмиды. При изучении процесса скрещивания бактерий оказалось, что способность клетки быть донором генетического материала связана с присутствием особого F-фактора. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) с бактериями-реципиентами (F"). В связи с этим можно указать, что сам термин «плазмида» был предложен для обозначения «полового» фактора бактерий (Джошуа Лёдерберг, 1952). F-плазмиды могут быть автономными и интегрированными. Встроенная в хромосому F-плазмида обеспечивает высокую частоту рекомбинации бактерий данного типа, поэтому их также обозначают как Hfr-плазмиды от англ. high frequency of recombinations, высокая частота рекомбинаций].

R-плазмиды кодируют устойчивость к лекарственным препаратам (например, к антибиотикам и сульфаниламидам, хотя некоторые детерминанты устойчивости правильнее рассматривать как связанные с транспозонами), а также к тяжёлым металлам. R-плазмиды включают все гены, ответственные за перенос факторов устойчивости из клетки в клетку.

Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов. Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгационной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.

Плазмиды - внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды . Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие :

1) устойчивость к антибиотикам;

2) образование колицинов;

3) продукция факторов патогенности;

4) способность к синтезу антибиотических веществ;

5) расщепление сложных органических веществ;

6) образование ферментов рестрикции и модификации.

Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.

Некоторые плазмиды находятся под строгим контролем. Это означает, что их репликация сопряжена с репликацией хромосомы так, что в каждой бактериальной клетке присутствует одна или, по крайней мере, несколько копий плазмид.

Число копий плазмид, находящихся под слабым контролем, может достигать от 10 до 200 на бактериальную клетку.

Для характеристики плазмидных репликонов их принято разбивать на группы совместимости. Несовместимость плазмид связана с неспособностью двух плазмид стабильно сохраняться в одной и той же бактериальной клетке. Некоторые плазмиды могут обратимо встраиваться в бактериальную хромосому и функционировать в виде единого репликона. Такие плазмиды называются интегративными или эписомами .

У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды , несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам - антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды , или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды , детерминирующие продукцию энтеротоксина.

Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ - бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т. д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных микроорганизмов.

Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов. Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя , выделенного от больного;

3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.